HPLC란?_정의, 구성, 원리 등

HPLC란?_정의, 구성, 원리 등

2021. 1. 23. 22:16ㆍ공부/화학공부

1. HPLC(High Performance Liquid Chromatography)의 원리

1) Chromatography란?

주어진 시료 중 정량 분석하고자 하는 성분을 분리하고 확인하는 수단. 시료 중의 여러 성분이 이동상과 고정상을 흐르면서 흡착, 분배, 이온 교환 또는 분자 크기 등의 차이로 분리되는 것을 말한다. 분리, 정성, 정량 등의 분석과 분리, 정제, 분취 목적에 이용된다.

원리적 측면에서 크게 흡착, 분배 크로마토그래피, 이동상 분류로는 가스, 액체, 초임계 크로마토그래피가 있으며, 이들을 개량한 것이므로 HPLC, GC-MS, LC-MS, GC-IR 등이 있다.

주요 크로마토그래피 원리에 따른 종류

원리적 측면

흡착 크로마토그래피 : 충진제(칼럼)에 대한 흡착력 차이 원리를 이용하여 물질을 분리·정제함.
분배 크로마토그래피 : 고정상(칼럼)과 이동상에 대한 분배력의 차이를 이용하여 물질을 분리함.

이동상 분류

Gas Chromatography
Liquid Chromatography(Absorption, Partition, Ion Exchange, Size Exclusion, Affinity)
Supercritical Chromatography

2) HPLC 분리 모드에 따른 분류

(1) Normal Phase Liquid Chromatography

작용기의 극성 정도에 따른 분리 작용
비수용성, 비극성 용매를 사용하며, 극성이 낮은 시료부터 용리
고정상의 흡착제(고체)의 표면과 이동상으로 사용되는 액체에 대한 친화력의 차이에 의한 분리 원리

(2)분리 원리에 따른 용출 순서

크로마토그래피는 크기가 큰 것부터 분리된다. 따라서 Benzoic acid> Toluene> Phenol> Benzene 순서로 용출된다.

(3) Reverse Liquid Chromatography

일반적인 Chromatography 기술
고체 기지체(C18, C8, CN 등)의 표면 액상과 이동상인 액체에 대한 분배력의 차이로 분리
고정상은 다공성 지지체에 화학적으로 결합되어 있다.
일반적으로 극성 용매를 사용하며, 비극성이 큰 물질이 나중에 용리된다.

(4) Ion exchange(이온 교환) : Ion Exchange Chromatography

이온 친화력에 의해 분리되며 용매의 동도에 따라 분리도가 다르다.
고정상 표면에 이온성을 지닌 화합물이 결합된다.
이동상으로 완충액(Buffer Solution)이 사용된다.
용출 순서는 pH, 이온 세기, 이동상 중의 이온 종류에 영향을 받는다.
종류에는 양이온(Cation) 교환, 음이온(Anion) 교환이 있다.
단백질의 전하 부위가 반대 전하의 교환 수지에 결합 후 염농도를 증가시켜 결합된 단백질을 용출시킨다.

(5) 음이온 교환 크로마토그래피

음이온 교환 수지는 +이며 통과하는 샘플 성분인 -를 끌어당긴다.

(6) Size Exclusion(분자 크기) : Gel Filtration, Gel Permeation

분자 크기에 따라 분리도가 다르다.
충진제 : Styrene, Divinylbenzene, 일정 크기의 Pore를 가진 충전물을 사용한다.
물리적인 분리, 큰 분자가 먼저 용출되고 작은 분자가 나중에 용출된다.
용출 순서는 pH, 이온 세기, 이동상 중의 이온 종류에 영향을 받는다.
응용 : 고분자의 분자량 및 분자량 분포도를 구한다.

작은 분자는 충진재의 pore를 통과하기 때문에 큰 분자보다 천천히 분리된다.

3) HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)란?

액체 크로마토그래피는 큰 직경의 관을 사용하여 중력 또는 낮은 압력에 의한 유속을 사용함에 따라 분리 시간과 분석하는 데 많은 시간이 필요하다.

축적된 크로마토그래피의 발달로 몇 분 내로 분리와 정량을 할 수 있는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 개발되었다. 이는 칼럼 안에 들어있는 고정상의 충진제와 장치의 개선, 개량에 의해 고속 고성능 분리가 가능하다.

충진제는 미세하고도 입도가 고른 수형으로 하여 고도의 분리가 가능하기 때문에 흐름에 대한 저항이 높아져 분리할 용액을 고압으로 보내야 하기 때문에 '고압 액체크로마토그래피(high pressure liquid chromatography)'라고도 하며, 또한 분리가 빠르기 때문에 '고속 액체 크로마토그래피(high speed liquid chromatography)'라고도 한다.

(1) HPLC의 장점

고성능 액체 크로마토 그래피(HPLC)는 휘발성이 문제가 되지 않으므로 분자량이 큰 물질의 분석에도 사용이 가능하다.

GC(Gas Chromatography)가 LC에 비하여 이동상의 차이 때문에 신속한 분석법이었으나 근래에는 HPLC가 분리 능력이나 응용 범위 면에서 신속·정확한 방법으로 각광받고 있다. GC의 경우 일반적인 사용 온도 범위(약 350℃) 이하에서 기화되지 않는 비휘발성 물질이며 열변성이나 열분해를 쉽게 받는 시료는 일반적으로 직접 분리할 수 없다. 하지만 HPLC는 시료가 상온에서 용해 불가능하여 가온할 필요가 없는 경우를 제외하면 온도와 관계없이 용매가 용해되는 시료는 모두 분리가 가능하다.

	HPLC	GC
시료 휘발성	휘발성이 필요치 않음. 시료는 이동상에 용해함.	휘발성
시료 극성도	극성 및 비극성 화합물의 분리 이온성 물질도 분리	비극성 및 극성 화합물
시료 분자량	이론적인 한계치 없음. 실제적으로 용해성에 제한됨.	일반적으로 500amu 이하
분리 기작	고정상과 이동상 사이에서 일어남.	이동상은 단지 샘플을 이동하는 역할을 함. 고정상과 샘플의 친화력
검출기	UV-VIS 검출기, 형광 검출기(FD), RID 등	일반적으로 FID 사용

(2) HPLC의 기본 구조

미세한 분말이 충진된 관을 사용해 빠르고 효율적인 분리를 위해 압력과 이를 조절할 수 있는 장치이다.

크로마토그래피의 정의 : 적절한 정지상과 이동상을 사용하여 시료들이 섞여 있는 혼합물을 이동속도 차이를 이용하여 분리하는 방법.

2.HPLC의 구조별 기능

1) HPLC 시스템의 구성

용매(이동상), 탈기장치(DGasser), Pump, 시료 주입기(Injectior), 칼럼, 칼럼 온도 조절(고정상), Data 처리(PC)

2) 구성별 기능

(1) 용매(이동상)

ㄱ. 용매 조건

용매의 순도는 HPLC급 사용
초순수(18MΩ 이상) 사용
측정하고자 하는 파장보다 낮은 UV cutoff를 가진 용매
용매 간 섞임성(Miscibility No.차 15 미만) ※아래 표 참고
시료에 대한 용해성이 있음.
낮은 점도, 고정상에 영향을 주지 않는 용매 사용.

용매의 Miscibility 출처 : https://images.app.goo.gl/73ur1wcK3KqJEdZM7

ㄴ. 주요 용매의 Elution Strength 비교

Water < Methanol < Acetonitrile < Isopropanol < Dioxane < Tetrahydrofuran < Mixed Solvent(form above)

용매 세기가 센 이동상일수록 분석 성분을 칼럼에서 빨리 용출시킨다.
용매 세기가 약한 이동상은 분리를 향상시킬수는 있으나 칼럼에 오래 머무르게 된다.

ㄷ. 용매 조성 비율에 따른 Retention Time(RT, 머무름 시간)의 영향

유기 용매 비율이 높아질수록 RT(머무름 시간)는 빨라진다.

(2) 탈기 장치(DGasser)

목적: 이동상의 기포, 용존 산소 등을 제거
방법: 진공 여과, Ultra-Sonication, On-Line Degassing
On-Line Degassing 원리 : 용매가 Membrane Tube를 지나가면서 Gas는 제거되고 Liquid는 통과시키면서 일정한 진공 상태는 유지한다.

(3) Pump

ㄱ. 기능 : 이동상을 저장 용기에서 끌어내 시료 주입기로 연속적으로 밀어주는 역할을 한다.

ㄴ. 조건 : 일정한 압력과 유속을 유지해야 한다. 다양한 용매를 사용할 수 있어야 한다.

Isocratic(등용기 분석) : 분석 시간 동안 이동상 조성 불변
Gradient(기울기 분석) : 분석 시간 동안 이동상 조성이 시간에 따라 변한다.

ㄷ. Pump Type

Isocratic Pump : QA·QC 응용에 맞는 설계
Binary Pump : High-Pressure 혼합 원리에 의해 설계
Quaternary Pump : 용매 혼합의 최고 유연성 제공

(4) 시료 주입기(Injector)

ㄱ. 기능: 분석하려는 시료를 용매(이동상)로 실어준다.

ㄴ. 종류

Manual Injector(수동 주입기)
Auto Injector(자동 주입기)

(5) 칼럼( TCC: Thermostatted Cluimn Compartment)

기능 : 분리능 향상, 분석 결과 재현성을 위해 칼럼 온도 설정 및 유지 기능

(6) 검출기(Detector)

ㄱ. 기능: 칼럼에서 분리된 성분이 검출기를 통과해 성분의 존재와 양을 인식하여 전기적 신호로 바꿔준다.