PCR의 정의/작동원리/조건

1.What is PCR?

 

PCR장비 사진

 

중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) : DNA의 원하는 부분을 복제·증폭시키는 분자생물학적인 기술이다. 이 기술은 사람의 게놈과 같은 매우 복잡하며 양이 지극히 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. 또한 증폭에 필요한 시간이 2시간 정도로 짧으며, 실험 과정이 단순하고, 전자동 기계로 증폭할 수 있기 때문에, PCR과 여기서 파생한 여러가지 기술은 분자생물학, 의료, 범죄 수사, 생물의 분류 등 DNA를 취급하는 작업 전반에서 지극히 중요한 역할을 담당하고 있다.

2.PCR의 유래

1984년에 캐리 멀리스가 특정 DNA 서열을 증폭하기 위한 방법을 고안하여 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)이라고 불렀다. 1985년에 중합효소를 클레나우 중합효소(Klenow polymerase)로 사용하는 PCR이 처음 공식적으로 발표됐다. 클레나우 중합효소는 열에 약했기 때문에 매 주기마다 효소를 새로 넣어 주어야 했고 생성물의 최대 길이는 400bp에 불과했다. 1988년에 DNA 중합효소로 Thermophilus aquaticus라는 미생물(극 호열균)의 DNA 중합효소인 Taq를 사용한 논문이 발행되었다. 열에 강한 이 중합효소는 PCR의 효율을 월등히 끌어올렸다.

3.PCR은 어떤 과정으로 이루어지나?

 

PCR의 각 단계 설명 그림

 

PCR에는 일련의 세 개의 단계가 있고 30~40회 정도 반복된다.

 1)DNA의 변성 (Denaturation) : 92 °C ~ 95 °C로 가열하여 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 분리시킨다. 변성온도는 DMA 내에 있는 G+C의 양과 DNA의 길이에 따라 달라진다. 높은 온도일수록 단일가닥 DNA 로 잘 이행되지만 Taq DNA 중합효소도 온도가 아주 높은 상태에서는 변성되어 사용하지 못하게 될 수 있으므로 보통 94 °C로 한다. 분리된 각각의 DNA는 주형(Template)으로서 역할을 하게된다.

 2)프라이머의 결합 (Annealing) : 50 °C ~ 65 °C에서 진행된다. 프라이머가 자신의 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖고 있는 DNA에 결합하는 단계이다. 염기간의 결합은 G와 C는 세 군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두 군데에서 결합이 일어나므로 G-C 결합이 A-T결합보다 강하다. 따라서 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주는 것이 좋다. 일반적으로 G-C content 가 50%가 되는 프라이머 쌍을 이용하는 것이 바람직하다. 보통 30초가량 지속되는데 이 단계에서 5'→3'방향으로 DNA의 합성이 시작된다. Annealing온도는 반응의 정확성을 결정하는 중요한 요소인데, 만약 온도를 너무 높게 하면 프라이머가 template DNA에 너무 약하게 결합되어 증폭된 DNA산물이 매우 적어진다. 반면에 온도를 너무 낮게 하면 프라이머가 비특이적으로 결합하기 때문에 원하지 않는 DNA가 증폭될 수 있다.

 3)DNA의 신장 (Elongation or Extension) : 70 °C ~ 74 °C 에서 시행하며 원하는 PCR산물의 크기가 크거나 반응효소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시킬 수도 있다. Taq 중합효소는 보통 1분에 2,000-4,000 염기쌍을 중합할 수 있으므로 원하는 PCR산물의 크기 1kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어난다. 마지막 cycle에는 약 10분 정도 시간을 충분히 주는 것이 좋다.

이 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 20∼40회) DNA의 원하는 부분을 증폭시키는 것이 PCR 의 원리이다.

 

PCR산물을 전기영동한 agarose gel.

 

원하는 부분을 제대로 증폭시켰는지 확인하기 위해서 PCR산물의 크기를 비교할 수 있는 agarose gel 전기영동을 이용하는 것이 일반적이다. PCR산물의 크기는 DNA ladder라 불리는 것과의 비교를 통해 대략적으로 알 수 있다.

위의 그림은 PCR 산물을 전기영동한 agarose gel 사진이다. 각각 다른 3개의 primer를 이용해 전기영동하였다. Tissue 1에는 해당 유전자가 없는 반면 Tissue 2와 3에는 유전자가 증폭된 것이 확인된다. 양성대조군(Positive Control)을 사용하였고, 1kb DNA ladder를 사용했다.

4.PCR의 종류

PCR은 DNA, RNA수준의 PCR로 나뉠 수 있다. 보통 유전자를 얻는 실험을 할 경우, 그 유전자의 전체를 보려는 것이 아닌 유전자 안에서의 특정 유전자를 관찰하는 것이 목적이다. 하지만 DNA를 바로 PCR하게 되면 특정 유전자를 얻기 힘들고 진핵 생물의 경우, 인트론(Intron; 비발현부위)이 같이 나오는 등 여러 가지 문제점이 있다. 그것을 해결하기 위해 특정 유전자에 프라이머를 붙인 다음, PCR을 DNA수준이 아닌 RNA수준에서 하는 역전사-PCR(RT(Reverse Transcriptase)-PCR)이 있다. 요즘에는 반응의 결과를 극대화하기 위해 Taq 중합효소 뿐만 아니라 여러 회사들에서 독자적으로 개발한 복합효소를 사용하기도 한다.

5.PCR을 위해 필요한 것

중합효소 연쇄 반응(PCR)을 일으키기 위해서는 다음과 같은 것들이 필요하다.

• 복제할 DNA
• 프라이머: DNA 복제가 시작되는 지점을 제공한다.
• DNA 중합효소(Taq): 중합효소 연쇄 반응이 일어나는 과정에서 가열과 냉각이 반복되기 때문에 열에 변성이 일어나지 않아야 한다.
• DNA 중합효소용 완충용액: 효소가 활성을 얻는 데 필요한 것들이 들어있다.
• dNTP: DNA 합성 될때 재료로 이용되는 3개의 인산이 결합된 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 합성에 필요한 4가지 염기의 뉴클레오 타이드를 모두 제공해야 되어야 함으로dATP,dTTP,dGTP,dCTP 모두 필요로 한다.

Reference : https://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction

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